Characterization of the Cell-Penetrating Properties of the Epstein-Barr Virus ZEBRA Trans-activator
Caractérisation de la propriété de la protéine ZEBRA du virus Epstein-Barr à pénétrer dans les cellules
Résumé
The basic-leucine zipper (bZIP) transcriptional activator ZEBRA of the Epstein - Barr virus was recently shown to cross the outer membrane of live cells and to accumulate in the nucleus of lymphocytes. During this PhD study, I investigated the potential application of ZEBRA as a transporter protein to facilitate transduction of cargo proteins. The analysis of different truncated forms of ZEBRA revealed that the minimal domain (MD) required for internalization was spanning residues 178-220. The MD efficiently transported reporter proteins, such as EGFP and β-galactosidase, into several normal and tumor cell lines. Functionality of internalized cargo proteins was confirmed by β-galactosidase activity in transduced cells, and no MD-associated cell toxicity was detected. Translocation of MD through the cell membrane required binding to cell surface associated heparan sulfate proteoglycans as shown by strong inhibition of protein uptake in presence of heparin. Furthermore, internalization was blocked at 4 °C, whereas no ATP was required as witnessed by an only 25 % decreased uptake efficiency in energy-depleted cells. Common endocytotic inhibitors had no significant impact on MD-EGFP uptake. Only methyl-β-cyclodextrin (MβCD) inhibited MD-EGFP uptake by 40 % indicating the implication of the lipid raft mediated endocytotic pathway. These data suggest that ZEBRA-MD-reporter protein transduction occurs mostly via direct translocation through the cell membrane and not by endocytosis. Tissue distribution of ZEBRA-MD-EGFP or ZEBRA-MD-β-galactosidase was analyzed after administration into mice. ZEBRA coupled reporter proteins were found in single cells of various tissues contrary to application of EGFP and β-galactosidase alone. In addition, the cell penetrating sequence of ZEBRA (MD) was fused to anti-tumor protein IL-24/MDA-7. Induced cell death after successful internalization of MD-IL-24/MDA-7 was proven by the cleavage of apoptosis specific caspases without showing difference between normal and tumor breast cells. The mechanism of MD-mediated internalization is suitable for the efficient delivery of biologically active proteins.
Il a été récemment démontré que l'activateur de transcription ZEBRA du virus Epstein-Barr contenant un motif "basic-leucine zipper (bZIP)" traverse la membrane externe des cellules vivantes et s'accumule dans le noyau des lymphocytes. Durant mon travail de thèse, j'ai étudié la possibilité d'utiliser ZEBRA comme protéine de transport afin de faciliter la transduction de protéines cargo. L'analyse de différentes formes tronquées de ZEBRA a permis de mettre en évidence que le domaine minimal (MD) nécessaire à l'internalisation inclut les résidus 178-220. Le MD a permis de transporter de manière efficace des protéines rapporteur comme la EGFP et la -galactosidase dans plusieurs lignées cellulaires normales et tumorales. La fonction des protéines cargo internalisées a été confirmée par l'activité -galactosidase dans les cellules transduites, et aucune toxicité cellulaire associée au MD n'a été détectée. La translocation du MD à travers la membrane cellulaire nécessite la liaison aux héparanes sulfates protéoglycans associés à la surface de la cellule comme cela a été démontré par la forte inhibition du transport de protéines en présence d'héparine. En outre, l'internalisation est également bloquée à basse température (4 °C). De plus, une réduction de seulement 25 % du transport de protéines cargo dans des cellules avec des stocks d'ATP épuisés démontre que l'internalisation est un processus indépendant de l'ATP. Les inhibiteurs classiques d'endocytose n'ont aucun effet significatif sur le transport de MD-EGFP. Seul le methyl--cyclodextrin inhibe de 40 % le transport de MD-EGFP, indiquant l'implication d'une voie d'endocytose médiée par les radeaux lipidiques. Ces résultats suggèrent que le transport de la protéine rapporteur ZEBRA-MD se produit principalement par translocation directe à travers la membrane cellulaire et non par endocytose. La distribution tissulaire d'EGFP ou de la β-galactosidase couplés ou non avec ZEBRA-MD a été étudiée après injection dans la souris. Seules les protéines de fusion avec ZEBRA-MD ont pu être révélées dans les cellules de différents tissus. De plus, la séquence de translocation de ZEBRA-MD a été fusionnée avec la protéine anti-tumorale IL-24/MDA-7. La mort cellulaire induite par l'internalisation de ZEBRA-MD-IL-24/MDA-7 a été mise en évidence par le clivage des caspases de la voie d'apoptose aussi dans des cellules normales que dans des cellules tumorales du sein. En conclusion, le mécanisme d'internalisation de ZEBRA-MD est approprié pour un transport efficace de protéines biologiquement actives.
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