Soutenance de thèse de B. CAULIER le 30/06/17

Benjamin CAULIER, de l’équipe TheREx, soutiendra sa thèse le vendredi 30 juin 2017 à 14h00, à l’amphithéâtre Serge Kampf du GIN "Grenoble Institut des Neurosciences", sur le thème :

« Développement d’un vecteur protéique pour la génération sécurisée de cellules souches pluripotentes induites. »

Directeurs de Thèse : Pr. Frédéric GARBAN et Dr. Marie-Claire DAGHER

Jury :

  • M. le Pr. Bernard LEBLEU - Rapporteur, Université Montpellier 2
  • M. le Pr. Jean-Christophe PAGES - Rapporteur, Université de Tours
  • Mme le Pr. Lydia CAMPOS-GUYOTAT - Examinateur, Université de Saint-Étienne
  • Mme le Pr. Catherine LACOMBE - Examinateur, Université Paris V
  • M le Dr. David LAURIN - Co-Encadrant, Établissement Français du Sang, Grenoble

Résumé : La génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) est très prometteuse en médecine régénérative, pour la modélisation physiopathologique et le criblage de nouveaux médicaments. A l’origine, des cellules somatiques ont été reprogrammées en iPSC par l’expression forcée de facteurs de transcription (FT) enrichis dans les cellules souches embryonnaires. Depuis, de nombreuses lignées d’iPSC ont été générées mais les vecteurs actuels les plus représentés et efficaces pour exprimer les FT sont les virus intégratifs. Ils comportent du matériel génétique. Des stratégies alternatives ont été développées dans un contexte de sécurisation et de transfert clinique mais sont ont encore besoin d’être acceptées par les comités d’éthique. La méthode la plus sûre et rationnelle serait alors d’apporter ces FT directement sous forme protéique mais le défi est de traverser les membranes cellulaires. Dans ce contexte, notre laboratoire a développé un peptide de pénétration cellulaire (CPP) basé sur le FT ZEBRA du virus d’Epstein-Barr. La séquence impliquée dans la prise en charge cellulaire a été caractérisée au laboratoire et se nomme MD (Minimal Domain). Elle est capable de vectoriser des protéines et des biomolécules de haut poids moléculaire via un mécanisme indépendant de l’endocytose, permettant leur internalisation sous une forme biologiquement active. Dans ce projet, nous avons produit et purifié les protéines Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, Klf4 et c-Myc chacune fusionnée au CPP MD. Ce domaine n’interfère pas avec la capacité d’Oct4 à lier sa séquence cible d’ADN. Le traitement in vitro de cellules primaires conduit à l’internalisation des protéines MD en 30 minutes à 1 heure. MD-Oct4 et MD-Nanog peuvent être localisés au noyau en 3 heures. Dans un contexte de reprogrammation, la combinaison de MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog et MD-Lin28 lors de traitements répétés conduit à l’activation transcriptionnelle de gènes cibles composant le réseau de pluripotence.

Mots-clés : cellules souches pluripotentes induites (iPSC), reprogrammation sécurisée, vecteur protéique, facteurs de transcription, peptide de pénétration cellulaire (CPP)

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Title : "Development of a protein vector for the secure generation of induced pluripotent stem cells"

Abstract : The generation of induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) holds great promise for regenerative medicine, disease modelling and drug screening. Leading the original cell to an iPSC has been originally made by the forced expression of Transcription Factors (TF) involved in embryonic stem cells. Since the discovery of those mechanisms, many teams have engineered iPSC by well-defined cell culture tools such as the use of retroviruses in order to express TF. Those techniques use genetic material. Delivery techniques have evolved but most of reprogramming experiments still need TF. Development of alternative strategies has been conducted in a context of clinical application but still needs to be accepted by ethics comities. Thus, the use of recombinant proteins instead of genetic material is safe and rational but the challenge is to access the intracellular medium. In this context, our laboratory has developed a cellpenetrating peptide (CPP) based on the Epstein-Barr virus ZEBRA TF. The sequence implicated in cellular uptake has been characterized and is named MD (Minimal Domain). It is able to translocate high molecular weight proteins in an endocytosis-independent mechanism, allowing the internalization of cargos in fully biologically active form. Here we develop 6 MD fusions at the N-terminus of the following TF : Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog & Lin28. This domain does not interfere with Oct4 capacity to associate with its own DNA sequence. Moreover, MD fused proteins transduce in vitro treated cells in 30 minutes to 1 hour ; MD-Oct4 & MD-Nanog can be localized in the nucleus after 3 hours only. In a context of reprogramming experiences, the combination of MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog and MD-Lin28 in repeated treatment leads to the activation of target genes transcription such as those constituting the pluripotency network.

Key words : induced pluripotent stem cells (iPSC), safe reprogramming, protein delivery system, transcription factors, cell-penetrating peptide (CPP)


Laboratoire TIMC-IMAG, Domaine de la Merci, 38706 La Tronche Cedex

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